生化实验–综合实验(ALDH2多态性分析)误差分析

发布于 2023-11-20  611 次阅读


实验误差分析


一、假阴性,不出现扩增条带:

  1. 模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有 Taq 酶抑制剂,③模板中蛋白质没有
    消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。
    ⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的
    消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其
    程序亦应固定不宜随意更改。
  2. 酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够
    而导致假阴性。
  3. 引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是 PCR 失败或扩增条
    带不理想、容易弥散的常见原因。
  4. Mg2+
    浓度:Mg2+
    离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大,浓度过高可降低 PCR 扩增的
    特异性,浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。

二、假阳性 ,出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,
亮度更高:

  1. 引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行 PCR
    扩增时,扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出
    现假阳性。需重新设计引物。
  2. 靶序列或扩增产物的交叉污染:可能存在整个基因组或大片段的交叉污染,导致假
    阳性。

三、出现非特异性扩增带 :
PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩
增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:

  1. 引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过
    高、退火温度过低,及 PCR 循环次数过多有关。
  2. 酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,
    酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
    四、出现片状拖带或涂抹带
    实验中出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因:
  3. 由于酶量过多或酶的质量差
  4. dNTP 浓度过高
  5. Mg2+浓度过高
  6. 退火温度过低
  7. 循环次数过多